elisa實(shí)驗每次結(jié)果都不一樣？影響ELISA結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的因素

  在elisa實(shí)驗中經(jīng)常會遇到ELISA實(shí)驗每次結(jié)果都不一樣情況。這種情況往往有多種因素影響，充分找到問題背后的不可靠因素，才能提高實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。上海通蔚從elisa實(shí)驗準(zhǔn)確性和可靠性因素為大家闡述！

  影響ELISA可靠性的因素

  能否持續(xù)產(chǎn)生準(zhǔn)確結(jié)果，是Elisa檢測的可靠性。當(dāng)同一樣本在相同條件下多次產(chǎn)生相同結(jié)果時，即為可靠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。

  在使用ELISA技術(shù)進(jìn)行血清學(xué)抗體檢測時，必須謹(jǐn)慎地理解ELISA的原理和可能存在的非特異性反應(yīng)。在使用間接ELISA的抗體測定中，由于與抗原無關(guān)的各種原因，可能會出現(xiàn)假陽性和陰性反應(yīng)。其中，最強(qiáng)烈的假陽性反應(yīng)是由BG噪聲反應(yīng)引起的，該反應(yīng)是由樣本標(biāo)本中的免疫球蛋白成分與固體表面的疏水結(jié)合引起的。BG噪聲反應(yīng)在不同樣本之間可能存在較大差異，這種差異與樣本中免疫球蛋白的種類和數(shù)量有關(guān)，也與其他因素有關(guān)，例如固相表面性質(zhì)、溶液環(huán)境等。在某些情況下，BG噪聲反應(yīng)的強(qiáng)度甚至可能超過真正的抗體-抗原反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。通過分析抗原未包被孔中的OD值并將其與抗原包被孔中獲得的值進(jìn)行比較，可以輕松識別BG噪聲反應(yīng)。遺憾的是，這一步經(jīng)常被忽視，并且僅在抗原包被孔中確定OD值。

  ELISA檢測的可靠性會受到多種因素的影響，其中包括：

  1.試劑質(zhì)量：抗體、酶和底物

  2.樣品或試劑受到污染

  3.過程中的時間長度和孵化溫度

  4.由于試劑處理和儲存不當(dāng)導(dǎo)致降解和失去活性

  影響ELISA準(zhǔn)確性的因素

  1.能否正確識別靶 抗原的存在與否，是ELISA檢測的準(zhǔn)確性。在選擇試劑盒方面，高特異性和敏感性是非常重要！ 除此之外，要留意樣本問題、操作問題等來排除相關(guān)問題。

  2.檢測所用試劑（包括抗原、抗體和酶）的質(zhì)量會影響準(zhǔn)確性。如果使用質(zhì)量差的試劑，可能會產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。

  3.在樣品準(zhǔn)備過程中，例如樣品的采集、儲存、處理和加工等錯誤，污染會影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  4.當(dāng)測試檢測到與目標(biāo)抗原或抗體相似但不相同的物質(zhì)時，就會發(fā)生交叉反應(yīng)。假設(shè)你正在使用ELISA檢測某種病毒的抗體。如果樣本中存在與該病毒抗體非常相似的其他病毒抗體，那么這些相似的抗體可能會與ELISA板上的抗原結(jié)合，產(chǎn)生一個信號。這會讓你誤以為樣本中存在目標(biāo)病毒的抗體，實(shí)際上只是存在一個相似但不同的抗體。

  5.操作員未遵循制造商的說明而導(dǎo)致的錯誤

  6.通過選擇合適的樣品制備和選擇合適的試劑制備，可以最大限度地減少高背景噪音、不一致的結(jié)果和低信號強(qiáng)度。

  7.試劑盒靈敏度和特異性。試劑盒靈敏度低的檢測可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，而靈敏度高的檢測可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。特異性是指檢測方法能準(zhǔn)確區(qū)分目標(biāo)抗原或抗體和非目標(biāo)物質(zhì)的能力。在高特異性的檢測中，只有目標(biāo)抗原或抗體會被識別并檢測到，而不會與相似但不同的物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)。

  樣品制備

  根據(jù)樣本類型和期望的檢測結(jié)果選擇合適的方法非常重要。在樣本制備過程中，需要考慮一些常見干擾因素，例如樣本中可能存在與目標(biāo)抗原結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，導(dǎo)致交叉反應(yīng)；或者樣本中存在與抗體發(fā)生非特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如血紅蛋白、脂類等；也可能存在目標(biāo)物質(zhì)與非目標(biāo)物質(zhì)的非特異性結(jié)合，例如目標(biāo)物質(zhì)與ELISA板的非特異性吸附。

  樣品質(zhì)量、檢測條件（溫度和pH值）、孵育時間和試劑質(zhì)量都會影響準(zhǔn)確性。

  通過適當(dāng)?shù)臉悠诽幚砗椭苽湟约笆褂每垢蓴_的檢測方式，可以最大限度地減少可能造成干擾的各種因素，通過適當(dāng)?shù)臉颖咎幚砗椭苽?，例如離心去除紅細(xì)胞、使用抗體預(yù)處理方法、選擇特異性更高、交叉反應(yīng)更小的抗體，以及使用抗干擾的試劑盒，可以最大限度地減少這些因素的影響，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  干擾ELISA檢測的因素可能出現(xiàn)在實(shí)驗過程的任何階段，從標(biāo)本采集開始。酶標(biāo)板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶 抗原、檢測抗體、酶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號檢測的質(zhì)量和完整性都可能干擾ELISA檢測的正常進(jìn)行。

檢測優(yōu)化

  優(yōu)化涉及識別和最小化測定中的變異源，例如試劑濃度或孵育時間的變化。影響測定優(yōu)化的因素包括識別和最小化測定中的變異源，例如試劑濃度變化。這可以通過適當(dāng)?shù)膶φ蘸蜏y試不同的試劑和條件組合來實(shí)現(xiàn)。系統(tǒng)方法、對照和驗證以及抗體、酶 底物系統(tǒng)和反應(yīng)緩沖液pH的選擇可以提高ELISA測試的準(zhǔn)確性。

  可以采用各種策略來優(yōu)化ELISA實(shí)驗，包括使用適當(dāng)?shù)姆忾]緩沖液、優(yōu)化抗原濃度和檢測抗體濃度以及調(diào)整孵育時間和溫度。選擇確保優(yōu)化信噪比和測定動態(tài)范圍的試劑（酶和底物）非常重要。

  DoE是一種強(qiáng)大的工具，可以成功優(yōu)化任何受多種因素影響的過程。

  必須確保ELISA程序的標(biāo)準(zhǔn)化，以保持一致性。

   數(shù)據(jù)分析

  準(zhǔn)確性和可靠性取決于選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法、識別和糾正異常值以及適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。ELISA測試產(chǎn)生的數(shù)據(jù)通常很復(fù)雜，需要仔細(xì)分析以避免錯誤或偏差。

  數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化需要考慮初始樣品濃度的差異和測定條件的變化。標(biāo)準(zhǔn)化方法有多種，包括使用內(nèi)標(biāo)、陽性對照和樣品稀釋因子。其選擇應(yīng)基于具體的實(shí)驗設(shè)計和測定要求。

  異常值可能由于技術(shù)錯誤或生物變異而出現(xiàn)，可以使用格魯布斯檢驗來識別，然后使用插值或代換法將其去除，并使用預(yù)期范圍內(nèi)的值進(jìn)行校正。

  統(tǒng)計方法的選擇應(yīng)基于實(shí)驗設(shè)計、數(shù)據(jù)收集類型和要解決的研究問題。ELISA數(shù)據(jù)分析中使用的常見統(tǒng)計方法包括t檢驗、方差分析、回歸分析和相關(guān)性分析。

  ELISA測試結(jié)果準(zhǔn)確可靠，這取決于適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析。遵循良好的實(shí)驗室規(guī)范（包括適當(dāng)?shù)奈臋n和數(shù)據(jù)管理）至關(guān)重要，以確保數(shù)據(jù)的完整性和可重復(fù)性。

  測試了分析ELISA數(shù)據(jù)的不同方法，包括使用原始光密度(OD)值、標(biāo)準(zhǔn)化OD值和二分（陽性/陰性）結(jié)果。作者使用受試者工作特征(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)分析比較了每種方法的靈敏度和特異性。

  OD值的標(biāo)準(zhǔn)化提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。建議使用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，例如Mann-WhitneyU檢驗，來評估組間差異并控制測定間變異性。建議使用對數(shù)轉(zhuǎn)換或樣本標(biāo)準(zhǔn)化等標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)來進(jìn)一步控制測定間變異性。