發(fā)布時間:2021-06-11 發(fā)布作者:上海通蔚生物
酶標板作為ELISA檢測實驗中的輔材,起著舉足輕重的作用并直接影響最終實驗結果,酶標板的好壞主要取決于其對蛋白吸附的靈敏度、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購酶標板批次間的差異。因此,選擇一款蛋白吸附靈敏度高、對蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標板產(chǎn)品,是實驗者獲得可靠、穩(wěn)定實驗結果的保障。
酶標板分類: 根據(jù)不同的分類標準,酶標板有著不同的分類。
一、根據(jù)孔數(shù),可分為96孔、48孔等,由于酶標板主要是配合酶標儀用,目前市面上的酶標儀最多為96孔,因此酶標板最為常用的也是96孔。
二、根據(jù)其底部的不同,又分為平底的,U型底、V型底等。平底的折射率低,適于在酶標儀檢測;U型底的酶標板折射率較高,方便加樣、吸樣、混勻等操作,可以不用放在酶標儀上,直接通過目測觀察顏色變化情況,從而判定有無相應的免疫反應。V底的酶標板可以精確的吸取樣品。
三、根據(jù)酶標板與蛋白和其它分子結合能力的不同,又分為高結合力、中結合力和氨基化等。
(1) 高結合力
此種酶標板,表面經(jīng)處理后,其蛋白結合能力大大增強,可達300~400ng IgG/cm2,主要結合的蛋白分子量>10kD。使用該類酶標板可提高敏感性,并可相對減少包被蛋白的濃度和用量,不足之處為較易產(chǎn)生非特異性反應。抗原或抗體包被后,以非離子去污劑無法有效地封閉未結合蛋白的部位,需使用蛋白作為封閉劑。
(2) 中結合力
此類酶標板經(jīng)表面疏水鍵被動與蛋白結合,適合作為分子量>20kD的大分子蛋白的固相載體,其蛋白結合能力為200~300ng IgG/cm2。由于該類酶標板所具有的僅與大分子結合的特性,適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體,可降低潛在的非特異性交叉反應。該類板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液。
(3) 氨基化
這種酶標板經(jīng)表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基,其疏水鍵由親水鍵取代。該類酶標板適合作為小分子蛋白的固相載體。使用合適的緩沖液和pH值,其表面可通過離子鍵與帶負電荷的小分子結合。由于其表面的親水特性和可通過其它交聯(lián)劑共價結合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子。該類板的缺陷為由于降低了疏水性,一部分蛋白分子無法結合;此外,其表面需有效地封閉。由于親水和共價的表面特性,使用的封閉液必須能夠與非反應性氨基基團和所選擇的交聯(lián)劑中任何功能基團發(fā)生作用。
四、根據(jù)顏色可分為透明、黑色、白色
透明的是最常用的,用于最一般的酶聯(lián)免疫實驗。相對于透明的的酶標板,還有用于發(fā)光檢測用的不透明的酶標板,一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標板自身會有光吸收,所以它的信號相對于白色酶標板要低很多,因此一般用于檢測較強的光,如熒光檢測。而白色的酶標板就用于較弱的光檢測,常用于一般的化學發(fā)光。另外黑色的酶標板還可以消弱非特異反應帶來的問題。同時需要注意的是,用一般的酶標板不可以進行發(fā)光檢測,因為一般從化學發(fā)光反應中發(fā)射出的光是各向同性,如果用透明的酶標板,光不僅會從垂直方向發(fā)散,還會從水平方向發(fā)散,使得光極易通過各個孔之間的間隙和孔壁,從而導致各孔的光吸收值受到相鄰孔發(fā)射光的影響。
酶標板性能判斷
良好的酶標板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。酶標板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,因此,每一批號的酶標板在使用前須事先檢查其性能。
常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內(nèi)加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應后,分別測每孔溶液的吸光度??刂品磻獥l件,使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差,應小于10%。以下以A、B、C三款酶標板為例。
直接法:檢測Human IgG在酶標板表面的吸附
雙抗體夾心法:包被山羊抗人抗體檢測陽性血清中抗原
上圖可以看出,這三類酶標板中,A類酶標板具有更好的蛋白吸附效果,同時也提高蛋白吸附的靈敏度,能夠提供更為可靠的實驗數(shù)據(jù)。
另外,可以詢問酶標板的批內(nèi)差異,以下是某款酶標板的批內(nèi)差異。
由批內(nèi)差異數(shù)據(jù)圖可以看出,該酶標板具有很好地批間穩(wěn)定性,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)差異均在5.0%附近,明顯低于業(yè)內(nèi)關于臨床免疫反應用酶標板的質(zhì)量控制標準中批內(nèi)變異系數(shù)低于10.0%的要求,因此也適合用于ELISA實驗。