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【通蔚生物】:酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒測(cè)定意義

發(fā)布時(shí)間:2024-04-24     發(fā)布作者:上海通蔚生物

通蔚生物酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒測(cè)定意義如下:
酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒
ACP 是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、
醬油釀造、飼料等。
測(cè)定原理:
酸性條件下,ACP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán);鎢藍(lán)
在 680nm 有特征吸收峰,通過測(cè)定其吸光度增加,來計(jì)算 ACP 活性。
自備儀器和樣品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿、1.5 mL EP 管和蒸餾水。
試劑組成和配置:
液體一:1.5mL×1 支,4℃保存。
液體二:1mL×1 支,4℃保存。
試劑一的配制:臨用前按液體一:液體二:蒸餾水=76(μL):17(μL):18(mL)的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)
用,如出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。
試劑三:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加入 20 mL 試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一
層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱 15-30 分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出
現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 50 mL 蒸餾水溶解。
試劑五:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體 1mL×1 支,0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提?。?br /> 1. 試劑一的配制:見試劑的組成和配制。
2. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試
劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心 10min,取上清,即粗酶液。
3. 血清或培養(yǎng)液:直接測(cè)定。
4. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞
加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后
8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作:
1.分光光度計(jì)預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 680 nm,蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二、試劑三和試劑四置于 30℃水浴保溫 30min。
3. 對(duì)照管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液,200μL 試劑二,混勻后置于 30℃水浴保溫 10min;加入 200μL
試劑三,混勻后 8000g, 4℃離心 10min;取 200μL 上清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 試劑四,200μL
試劑五,混勻后置于 30℃水浴保溫 20min,于 680nm 測(cè)定光吸收,記為 A 對(duì)照管。
4. 測(cè)定管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液,200μL 試劑三,混勻后置于 30℃水浴保溫 10min;加入 200μL
試劑二,混勻后 8000g, 4℃離心 10min;取 200μL 上清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 試劑四,200μL
試劑五,混勻后置于 30℃水浴保溫 20min,于 680nm 測(cè)定光吸收,記為 A 測(cè)定管。(注意與空白管不同,
先加試劑三,后加試劑二)
5. 空白管:取 EP 管,加入 200μL 蒸餾水,1000μL 試劑四,200μL 試劑五,混勻后置于 30℃水浴保溫
20min,于 680nm 測(cè)定光吸收,記為 A 空白管。
6. 標(biāo)準(zhǔn)管:取 EP 管,加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)品,1000μL 試劑四,200μL 試劑五,混勻后置于 30℃水浴保溫
20min,于 680nm 測(cè)定光吸收,記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
ACP 活性計(jì)算公式:
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
ACP 活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性(nmol/min /mg prot)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總
÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
ACP 活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性(nmol/min /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總÷
(W×V1÷V2)÷T= 125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
3. 按照液體體積計(jì)算
ACP 活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性(nmol/min/mL)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總÷V1÷T=
125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
1. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
ACP 活性單位定義:30℃每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪氨酸為 1 個(gè)酶活單位。
ACP 活性(nmol/min /104 cell)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總÷
(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2)÷T= 125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μ mol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;V 反總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度
(mg/mL);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),0.1 mL;V2:提取液總體積(mL),1mL;T:催化
反應(yīng)時(shí)間(min),10min;W:樣品質(zhì)量(g)。
注意事項(xiàng):
1.試劑一按操作指示配制,用多少配多少,出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。
2.臨用前配制的試劑配置好后 3 天內(nèi)使用完畢。
上海通蔚生物科技有限公司自成立以來,一向以“優(yōu)異的酸性蛋白酶(ACP)測(cè)試盒產(chǎn)品,優(yōu)惠的報(bào)價(jià)和交心的服務(wù)”得到廣闊新老客戶的必定和支撐,不斷提高自身的專業(yè)技術(shù)水平和服務(wù)質(zhì)量,為您提供非常好的產(chǎn)品。