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elisa試劑盒如何定量蛋白濃度？通蔚帶您全面了解elisa數(shù)據(jù)

發(fā)布時間：2024-04-03     發(fā)布作者：通蔚生物

  當您進行組織樣本的ELISA實驗時，蛋白濃度的均一性是非常關(guān)鍵的，因為蛋白濃度的差異可能導致結(jié)果的不一致性。因此，確實需要對每個樣品進行蛋白定量以確保各樣品有相同或已知的蛋白濃度。今天，通蔚給大家介紹一下elisa如何定量蛋白濃度，在開始之前，我們先知道elisa測定生物樣品中目標蛋白的濃度的三種類型：
  
  定量：可以通過系列稀釋的標準蛋白的OD值和相應(yīng)的已知濃度來生成標準曲線。樣品的 ELISA 數(shù)據(jù)可以從標準曲線插值來計算樣品中目標蛋白的濃度。
  
  定性：我們簡單地從檢測中得到陰性或陽性結(jié)果，通過與陰性對照比較來確定某個樣品中是否存在任何目標蛋白。
  
  半定量：使用這種類型的ELISA 試劑盒，我們可以獲得陰性或陽性結(jié)果，并比較檢測樣品中的目標蛋白水平，因為樣品的吸光度水平將直接對應(yīng)于目標蛋白的水平專注。然而，由于試劑盒中沒有任何標準蛋白，我們無法計算出準確的濃度。
  
  一般來說，使用定量ELISA試劑盒，您可以對樣品中的目標蛋白進行定量，因為您測試了一系列已知濃度的標準蛋白。當您使用定量 ELISA 試劑盒分析 ELISA 數(shù)據(jù)時，您必須繪制平均吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，并繪制最適合您的標準結(jié)果的曲線，然后將樣品的吸光度插入曲線以計算濃度。該 ELISA 標準曲線實驗方案將為您提供有關(guān)如何使用定量 ELISA 試劑盒逐步計算 ELISA 結(jié)果的全面說明。
  
  關(guān)于樣品中目標蛋白的濃度，向您推薦一款使用簡單的ELISA數(shù)據(jù)分析軟件Curve Expert 1.4。市場上還有許多其他曲線擬合軟件可以進行 ELISA 計算，例如GraphPad Prism，或者您也可以使用普通的 MS Excel 進行分析。
  
  一、如何使用Curve Expert繪制標準曲線并計算目標蛋白濃度？
  
  處理 ELISA 數(shù)據(jù)分析分為三個步驟：
  
  1、將標準品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  2、選擇最佳擬合曲線
  
  3、通過插值計算目標蛋白的濃度
  
  現(xiàn)在我將一步步向您展示如何制作ELISA標準曲線。
  
  1. 將標準品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  進行 ELISA 測定后，您可以將原始數(shù)據(jù)分為三個部分。建議運行一式兩份或一式三份的標準品和樣品。作為zui佳實踐，您最好將重復(fù)的 CV 控制在 8% 以下。
  
  第1部分：已知濃度標準品的吸光度
  
  第 2 部分：空白孔/背景的吸光度
  
  第3部分：未知濃度樣品的吸光度
  
  標準品用樣品稀釋劑連續(xù)稀釋。樣品可能還需要稀釋。由于即使在檢測波長處不存在蛋白質(zhì)，樣品稀釋劑也具有吸光度，因此我們在測定中使用樣品稀釋劑進行空白實驗以獲得背景 OD。通常的做法是從標準品和所有樣品的吸光度中減去空白孔的吸光度。
  
  這里我們以“Curve Expert 1.4”為例，向您展示如何操作該軟件并進行數(shù)據(jù)分析。
  
  1.1啟動“Curve Expert 1.4”。您可以看到下面的界面。


  
  1.2輸入標準品的OD值（X軸）和相應(yīng)的濃度（Y軸）。您可以將 Excel 工作表中的數(shù)據(jù)直接復(fù)制到軟件中的工作表中。數(shù)據(jù)圖出現(xiàn)在右下角。



  
  2.選擇最佳擬合曲線
  
  2.1 單擊[運行]按鈕，讓軟件檢查您的數(shù)據(jù)以選擇最佳的曲線擬合。選擇要包含在計算中的模型系列。通常，我們點擊 [ All On ] 來包含所有型號系列。如果考慮多項式族，則必須在“多項式約束”區(qū)域中指定軟件將考慮的多項式的最大次數(shù)。我們建議將多項式的最大次數(shù)設(shè)置為“4”。當然，如果不包括多項式族，則多項式約束將被忽略。然后按[確定]。



  
  2.2 然后進行計算，每條曲線擬合根據(jù)其標準誤差和相關(guān)系數(shù)進行排序，然后將最佳擬合顯示在圖形窗口中。



  
  雖然軟件會推薦最佳擬合曲線，但您仍然可以通過雙擊不同的回歸來手動選擇曲線。選擇“r”值最接近“1”的曲線。



  
  選擇適當?shù)那€擬合回歸很重要，因為樣品濃度將根據(jù)標準曲線計算。下圖說明了不同的 ELISA 標準曲線如何影響濃度計算的準確性。 “r”值越接近“1”，OD 和濃度之間的相關(guān)性越強。



  
  在本例中，我們最終選擇“有理函數(shù)”，因為與其他標準曲線相比，其“r”值最接近“1”。通過在任何繪圖窗口中按鼠標右鍵或按 Ctrl-M，您可以從繪圖菜單中進行選擇。通過點擊[復(fù)制]按鈕，您可以將標準圖形粘貼到Excel表格或Word文檔中。



  
  二、通過插值計算目標蛋白濃度
  
  如何計算濃度？有兩種方法可以計算目標蛋白的濃度。
  
  • 在軟件中分析 ELISA 數(shù)據(jù)
  

  該軟件可以輕松定位 x/y 點、微分以及通過從繪圖菜單中選擇“分析”或按 Ctrl-L 執(zhí)行的曲線擬合積分。在此示例中，我們希望通過評估給定 OD（X 值）下的曲線擬合來找到目標蛋白的濃度（Y 值）。只需在“At X=”字段中輸入要評估曲線擬合的點（x 值），然后按鍵盤上的[ Calculate ] 或 [ Enter ]。然后計算器將顯示相應(yīng)的 y 值。


  
  • 分析 MS Excel 表中的 ELISA 數(shù)據(jù)
  
  按 [ Info ] 按鈕打開模型信息對話框，其中提供應(yīng)用曲線擬合所需的所有信息以及有關(guān)給定模型性能的一些補充信息。該面板中包含的最重要的信息是模型參數(shù)的值。
  
  模型
  
  模型部分給出了數(shù)據(jù)建模方程，以便系數(shù)的解釋清晰。系數(shù)部分中的系數(shù) a、b、c 等與模型中顯示的相應(yīng)參數(shù)相匹配。
  
  系數(shù)
  

  系數(shù)部分給出當前模型的相關(guān)參數(shù)值——這些系數(shù)始終表示為 a、b、c、d 等。這些系數(shù)與模型部分中顯示的模型相匹配。如果系數(shù)列表超出了它們顯示的窗口范圍，則會出現(xiàn)一個滾動條，允許您滾動瀏覽參數(shù)。


  
  如果我們單擊[復(fù)制]，系數(shù)列表將被復(fù)制到剪貼板。然后將它們粘貼到任何 Excel 工作表中
  

  將X(OD)、a、b、c、d值分別帶入公式中，然后按鍵盤上的[ Enter ]鍵即可計算出濃度。為了得到最準確的結(jié)果，建議預(yù)先確定合適的稀釋倍數(shù)，確保稀釋后樣品中目標蛋白的濃度落在標準曲線范圍內(nèi)。如果樣品已被稀釋，則計算時應(yīng)考慮稀釋因子。



  

  標準曲線對于準確分析 ELISA 結(jié)果非常重要。因此，您應(yīng)該在每次測定中運行標準品，以避免由于每次測定的操作員、移液、孵育和溫度的差異而導致系統(tǒng)偏差。


  上述是以人TNF-α ELISA試劑盒為例通過Curve Expert繪制標準曲線并計算目標蛋白濃度，大家可以參考。Curve Expert軟件可能是一個收費的軟件，您可以通過Excel或其他軟件制作標準曲線，或者您可以將您的數(shù)據(jù)發(fā)送給我們，我們將為您處理數(shù)據(jù)。如果還有不明白的可以咨詢我們專業(yè)的elisa試劑盒顧問尋求免費解答！在這里通蔚祝您實驗順利！