PCR 技術(shù)新篇章：染料法 PCR 詳解

  上篇文章介紹了探針法PCR及它的工作原理，這篇文章，我們來認識下PCR技術(shù)—染料法PCR。這聽起來有點像探針法PCR兄弟，它們都屬于qPCR?，F(xiàn)在，我們一起來了解下染料法PCR。探針法 PCR可以參考這篇文章《探針法PCR工作原理詳解：從熒光到基因定量》

  什么是染料法PCR？

  染料法PCR是一種經(jīng)濟高效的qPCR，可基于DNA結(jié)合染料的熒光檢測來測量PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）過程中的雙鏈DNA擴增。除了qPCR混合物、無核酸酶水和DNA之外，它只需要兩個序列特異性引物，這使其成為觀察大量目標(biāo)時經(jīng)濟高效的選擇。

  染料法PCR是如何工作的？

  如前所述，染料法PCR使用DNA結(jié)合熒光染料。在與DNA結(jié)合之前，染料呈現(xiàn)低背景熒光。在擴增過程中，染料會與樣品中發(fā)現(xiàn)的任何雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合。這導(dǎo)致熒光的增加與每個循環(huán)中存在的PCR擴增子的增加成正比。

  每個PCR循環(huán)后測量熒光。當(dāng)足夠的熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合并具有比背景熒光更高的熒光時，就達到閾值循環(huán)(Ct)，也稱為定量循環(huán)(Cq)。Ct值用于定量樣品中目標(biāo)DNA的量（Ct水平越低，樣品中目標(biāo)DNA的量越大）。

圖1 熒光染料為 SYBR GreenⅠ染料

  染料法PCR被認為具有成本效益，因為每個目標(biāo)只需要兩個序列特異性引物，但由于這些引物是確定反應(yīng)特異性的唯一方法，因此它的特異性不如傳統(tǒng)PCR或探針法PCR。然而，它比購買探針法PCR的引物和探針要便宜得多。

  染料法PCR中引物的主要問題是它們往往會形成引物二聚體或非特異性擴增子。遺憾的是，該染料將檢測并結(jié)合任何雙鏈DNA，其中還包括所有脫靶，即非特異性擴增產(chǎn)物。這可能導(dǎo)致目標(biāo)序列的定量不準確。

  然而，有一種簡單的方法可以識別問題。可以使用熔解曲線來比較擴增產(chǎn)物的熔解溫度。這可以驗證擴增的特異性并檢查非特異性擴增產(chǎn)物的存在。

  熔解曲線分析基于以下事實：不同的雙鏈DNA鏈根據(jù)各種因素（GC含量、SNP等）在不同溫度下彼此解離。當(dāng)PCR產(chǎn)物被加熱并且雙鏈開始解離時，就會產(chǎn)生熔解曲線，在此期間熒光染料也從鏈上解離，因此可以檢測到熒光下降。

  qPCR機器完成數(shù)據(jù)收集后，您將獲得擴增圖，直觀地顯示qPCR期間DNA的積累情況。這些線條顯示了染料的熒光信號，該信號標(biāo)準化為被動參考染料（例如ROX）的信號減去qPCR機器生成的基線。它應(yīng)該看起來像這樣：

圖2 SolisFAST® SolisGreen® qPCR 混合物的擴增圖

  染料法PCR的優(yōu)點和缺點

  染料法PCR如此受科學(xué)家歡迎的原因有很多。這里是其中的一些：

  1、成本（僅2個引物）——比探針法PCR更經(jīng)濟的選擇。

  2、比探針法PCR更容易設(shè)計。同樣，前者只需要2個引物。后者需要2個引物和一個非常特殊放置的探針。

  3、與探針法PCR不同，除了目標(biāo)的基因之外，還可以檢測錯誤。這樣，下次就可以優(yōu)化實驗并獲得更好的結(jié)果。

  遺憾是，與所有方法一樣，染料法PCR并不適合所有實驗設(shè)計。以下是一些缺點：

  1、不可能進行多路復(fù)用。

  2、其特異性較低。

  染料法PCR有哪些染料可供選擇？

  染料法PCR最重要的部分當(dāng)然是染料。一些建議，幫助您為qPCR實驗選擇合適的染料。

  經(jīng)典且可能最常用的染料是SYBR®Green。然而，還有更好的選擇，可能還沒有那么流行，但值得考慮。其中之一是EvaGreen®，它在光譜上與SYBR®Green相似，因此使用時無需更改任何光學(xué)設(shè)置。EvaGreen®在室溫和PCR條件下都非常穩(wěn)定。它對濃度的抑制較小——可以增加染料的濃度以增加熒光，而不會擾亂反應(yīng)。這還可以實現(xiàn)更好的高分辨率熔體分析。此外，由于其新穎的“按需釋放”DNA結(jié)合機制，EvaGreen®染料的背景比SYBR®GreenI更少。最重要的是，EvaGreen®還被認為比SYBR®Green毒性更低、對環(huán)境更安全。

  另一種選擇是SolisGreen®，它也與其他常用的qPCR染料共享光譜特性?；?/span>SolisGreen®染料的qPCR混合物具有高靈敏度和更高的性能（更亮的熒光），目標(biāo)濃度低，顯示出更高的精度和技術(shù)重復(fù)之間的差異更小。

  當(dāng)然還有多種其他染料可供選擇，但所有SolisBioDyne產(chǎn)品均基于EvaGreen®或SolisGreen®，以確保良好的產(chǎn)品穩(wěn)定性、效率和可持續(xù)性。

  上述是染料法PCR介紹，通過上文你對染料法PCR有所了解。染料法PCR和探針法PCR有所差異，可以對比實驗來去了解之間的差異。具體選擇染料法和探針法要結(jié)合當(dāng)前的實驗。如果您對染料法還有什么疑問，可以咨詢我們在線技術(shù)尋求幫助。如果您想了解染料法試劑盒，歡迎前來咨詢。