避免實驗誤區(qū)：ELISA 試劑盒使用方法及注意事項

  ELISA試劑盒又叫“酶聯(lián)免疫試劑盒，”在生物實驗，是一種高敏感、特異性強，重復(fù)性好等檢測優(yōu)勢廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗各個領(lǐng)域中。對于ELISA試劑盒使用，有些科研小伙伴們有些不解，今天由上海通蔚生物為大家介紹一下ELISA試劑盒使用方法。我們從實驗前準(zhǔn)備、實驗步驟和結(jié)果分析及注意事項加以說明。

  1、試驗前準(zhǔn)備

  2、實驗步驟

  4、注意事項

圖1 通蔚ELISA試劑盒

  實驗前準(zhǔn)備

  閱讀說明書。在進(jìn)行ELISA實驗前，要充分了解ELISA說明書，了解實驗原理、操作步驟及注意事項！

  準(zhǔn)備實驗材料。通過閱讀說明書，準(zhǔn)備接下來ELISA實驗所需的器材及試劑。比如常見有酶標(biāo)板、抗體（一抗和二抗）、酶標(biāo)抗體和底物、封閉液、終止液和酶標(biāo)儀等。

  復(fù)溫試劑。在實驗之前，需要將試劑進(jìn)行復(fù)溫操作，可以保證試劑的穩(wěn)定性和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在開始實驗之前，應(yīng)將試劑盒從冰箱中取出，室溫放置15-30分鐘，使試劑恢復(fù)至室溫。

  配置洗滌液。洗滌液在ELISA實驗中起到去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾的重要作用。一般有2種方式：

  方式一：使用濃縮洗滌液。大多數(shù)ELISA試劑盒會提供濃縮洗滌液。你需要按照說明書上的比例，用蒸餾水或去離子水稀釋濃縮液。

  方式二：使用洗滌液粉劑。一些ELISA試劑盒會提供洗滌液粉劑。你需要按照說明書上的指示，將粉劑溶解于一定量的蒸餾水或去離子水中，并充分?jǐn)嚢柚镣耆芙狻?/span>

  不管采用上述哪種方式，其都要遵循說明書進(jìn)行配置，并嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

  準(zhǔn)備酶標(biāo)儀：打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置檢測波長。

圖2 酶標(biāo)儀

  實驗步驟

  ELISA實驗步驟通常有包被、洗滌、封閉、洗滌、加樣、洗滌、加酶標(biāo)抗體、洗滌、顯色、終止反應(yīng)和測定吸光度值。接下來以小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA試劑盒步驟說明使用方法。

  實驗原理

  試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。elisa實驗原理，可以參考《一文讀懂酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）原理及步驟》

圖3 ELISA試劑盒原理

  試劑準(zhǔn)備

  小鼠脂肪酸合成酶抑制劑（FASI）試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

  20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

  操作步驟：

  1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

  2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

  3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

  4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

  5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

  6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

  7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

  實驗結(jié)果計算

  以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

  注意事項

  1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

  2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

  3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

  4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

  5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

  6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。

  7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

  8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

  9.不能使用過期產(chǎn)品。

  10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

  上述為大家介紹了ELISA試劑盒使用方法，文中采用是小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA試劑盒，不同的試劑盒操作步驟有所差異，大家可以根據(jù)自己試劑盒說明書進(jìn)行對照操作。ELISA 試劑盒為科研和臨床診斷提供了方便快捷的檢測工具。通過正確使用 ELISA 試劑盒，可以獲得準(zhǔn)確可靠的實驗結(jié)果。