細胞解凍：步驟、技巧及注意事項

細胞通常以冷凍狀態(tài)交付。因此，正確解凍對于獲得高細胞存活率和理想的細胞狀態(tài)至關(guān)重要。本文將介紹細胞解凍方法和要點。

細胞解凍概述

閱讀細胞的數(shù)據(jù)表:仔細閱讀供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)表，了解特定細胞系的解凍步驟和建議。

1.準(zhǔn)備材料:預(yù)熱合適的培養(yǎng)基至37°C(或根據(jù)數(shù)據(jù)表)，并準(zhǔn)備好已滅菌的培養(yǎng)瓶/皿(如有需要，進行預(yù)先包被)。

2.取出細胞:從液氮或-80°C冰箱中取出凍存管。注意安全操作，避免凍傷。

3.快速解凍:將凍存管迅速放入37°C水浴中，并輕輕搖晃，使細胞盡快解凍(通常1-2分鐘)。避免完全解凍，凍存管中仍留有少量冰晶時即可取出。

4.稀釋細胞:將解凍的細胞緩慢加入預(yù)熱的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。根據(jù)數(shù)據(jù)表建議的比例進行稀釋。

5.孵育細胞:將細胞懸液轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶/皿中，并在推薦的溫度(通常37°C)和CO2濃度下孵育。

6.觀察細胞:在解凍后不同時間點(例如，24小時、48小時)觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)，確保細胞正常復(fù)蘇。

細胞解凍所需材料

1.細胞凍存管

2.培養(yǎng)基(參考細胞數(shù)據(jù)表確定最佳預(yù)熱溫度)

3.70%乙醇

4.臺盼藍(可選，用于評估細胞活力)

5.個人防護設(shè)備(實驗室手套、實驗服、防護眼鏡、液氮罐皮手套等)

6.用于運輸凍存管的容器(例如泡沫塑料盒，如果需要從液氮罐中取出細胞)

7.37°C水浴

8.移液器和合適的吸頭

9.小瓶支架(可選)

(如果需要進行后續(xù)細胞培養(yǎng)和觀察):

10.孵化器

11.培養(yǎng)瓶/皿和標(biāo)簽

12.倒置顯微鏡/相差顯微鏡

13.血細胞計數(shù)器(可選)

14.離心機(可選，如果需要去除DMSO)

細胞解凍步驟

1.查看數(shù)據(jù)表:仔細閱讀細胞隨附的數(shù)據(jù)表，了解具體的培養(yǎng)條件和解凍步驟。

2.準(zhǔn)備工作:在生物安全柜中進行所有操作。預(yù)熱培養(yǎng)基至37°C，準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶/皿并貼好標(biāo)簽(傳代號、細胞名稱、批號和日期)。

3.取出凍存管:從液氮罐或-80°C冰箱中取出凍存管。注意安全操作，佩戴合適的防護措施(例如低溫手套和護目鏡)。

4.處理液氮(如果需要):如果發(fā)現(xiàn)凍存管內(nèi)有液氮，應(yīng)在安全柜中靜置片刻，待液氮氣化后再打開。

5.解凍細胞:將凍存管迅速放入37°C水浴中，輕輕搖晃，使細胞盡快解凍(通常1-2分鐘，當(dāng)凍存管中仍留有少量冰晶時即可取出)。注意不要將蓋子浸入水中。

6.擦拭表面:用70%乙醇棉簽擦拭凍存管外表面。

7.稀釋細胞:在生物安全柜中打開凍存管，用移液器將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)熱培養(yǎng)基(例如5-10mL)的離心管中，輕輕混勻。

8. (可選)細胞計數(shù)和活力檢測:取少量細胞懸液，用臺盼藍染色，并用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)和活力評估。

貼壁細胞系:將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶/皿中，加入適量預(yù)熱培養(yǎng)基至推薦體積。

懸浮細胞系:以150xg離心5分鐘，棄上清，用新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶/皿中。

9.培養(yǎng)細胞:將細胞放入孵化器中，在指定的溫度和CO2濃度下培養(yǎng)。

10.觀察細胞:24小時后(或根據(jù)細胞類型調(diào)整時間)在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，并根據(jù)需要進行傳代培養(yǎng)。

解凍細胞時的注意事項

1.快速解凍:將凍存管在37°C水浴中快速解凍(通常1-2分鐘)，并輕輕搖晃，使內(nèi)容物均勻受熱。避免完全解凍，凍存管中仍留有少量冰晶時即可取出。

2.立即稀釋:將解凍的細胞懸液立即加入預(yù)熱至37°C的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。

3.去除DMSO(強烈建議):除非細胞系明確對DMSO不敏感且數(shù)據(jù)表中明確說明無需去除，否則建議通過離心(例如200-300xg，5分鐘)去除DMSO。棄去上清液，用新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細胞。

4.避免緩慢解凍:不要在室溫或培養(yǎng)箱中解凍細胞，因為緩慢解凍會降低細胞活力。

5.CO2培養(yǎng)箱:使用CO2培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)。如果沒有CO2培養(yǎng)箱，建議使用替代方案，例如含HEPES緩沖液的培養(yǎng)基。

6.傳代培養(yǎng):在細胞達到完全匯合之前進行傳代培養(yǎng)，以保持細胞的最佳生長狀態(tài)。一些細胞類型(例如NIH3T3)對接觸抑制特別敏感。

7.恢復(fù)緩慢的細胞:對于生長緩慢的細胞(例如一些雜交瘤)，可以考慮在補充有20%FBS和10%條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以促進其恢復(fù)。

以上，我們講解了細胞解凍的正確步驟和注意事項。正確執(zhí)行基本操作對實驗的效率和成功至關(guān)重要。尤其是在熟悉實驗步驟的過程中，您很可能會犯錯并失敗，因此請務(wù)必不時閱讀這些注意事項。